СИНТЕЗ ЦИКЛИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ С ТИОЭФИРНЫМИ МОСТИКАМИ
1. НАЗНАЧЕНИЕ
Метод предназначен для синтеза циклических пептидов, содержащих тиоэфирный мостик (C-S-C) вместо традиционного дисульфидного мостика (S-S). Тиоэфирные пептиды обладают повышенной стабильностью к восстановлению и увеличенным периодом полураспада в сыворотке крови (26-30 часов vs 1.4-1.9 минут).
Применение:
- Синтез стабилизированных терапевтических пептидов
- Разработка циклических пептидов для drug discovery
- Пептидные ингибиторы ферментов
- Циклические противомикробные пептиды
2. РЕАГЕНТЫ И МАТЕРИАЛЫ
| Реагент | Спецификация | Назначение |
|---|---|---|
| Диоктилсульфид (ДОС) | ≥99.1%, ООО «Экстрагент» | Источник тиоэфирного линкера |
| 2-Chlorotrityl chloride resin | 1.0-1.6 ммоль/г | Твердая фаза для SPPS |
| Fmoc-аминокислоты | >98%, стандартный набор | Строительные блоки |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | >98% | Цистеин с тритильной защитой |
| HBTU | >98% | Активатор карбоксильных групп |
| HOBt | >98% | Подавление рацемизации |
| DIPEA | >98% | Органическое основание |
| Пиперидин | >99% | Снятие Fmoc-защиты |
| DMF (ДМФА) | Пептидный синтез | Растворитель |
| DCM (ДХМ) | ХЧ | Промывки |
| TFA (ТФУ) | >99% | Расщепление пептида с смолы |
| Йод (I2) | ХЧ | Окисление тиольных групп (опционально) |
3. ОБОРУДОВАНИЕ
3.1. Реактор для твердофазного синтеза пептидов (SPPS reactor) с фриттой 3.2. Шейкер или вортекс 3.3. Вакуумный насос 3.4. HPLC для очистки (обратнофазовая C18 колонка) 3.5. LC-MS для характеризации 3.6. Лиофилизатор (freeze-dryer)
4. МЕТОДИКА СИНТЕЗА
4.1. Стратегия синтеза
Подход А: On-resin тиоэфирное сшивание
Шаг 1: Синтез линейного пептида с двумя Cys в позициях i, i+7
Шаг 2: Алкилирование первого Cys йодацетильной группой → Cys-S-CH2-COOH
Шаг 3: Реакция второго Cys с алкилированным Cys → формирование C-S-C мостика
Шаг 4: Расщепление с смолы → циклический пептид с тиоэфиром
Подход Б: Использование ДОС как тиоэфирного линкера (модифицированный)
Примечание: Прямое использование ДОС для формирования коротких тиоэфирных мостиков ограничено из-за длинной алкильной цепи (C8). Для пептидов предпочтительны короткие тиоэфирные линкеры (C2-C4). Однако ДОС может использоваться для:
- Функционализации поверхностей (иммобилизация пептидов)
- Синтеза длинных тиоэфирных спейсеров
- Модификации N/C-терминусов пептидов
4.2. Практический протокол (с йодацетильным методом)
Шаг 1: Сборка линейного пептида на смоле
- Загрузить первую Fmoc-аминокислоту на 2-chlorotrityl chloride resin:
- Растворить Fmoc-aa-OH (3 экв.) в DCM
- Добавить DIPEA (6 экв.)
- Добавить к смоле, встряхивать 2 часа
- Блокировать непрореагировавшие участки MeOH/DIPEA (8:1), 30 мин
- Snятие Fmoc-защиты:
- Промыть смолу DMF (3 × 5 мл)
- Обработать 20% пиперидин в DMF (2 × 10 мин)
- Промыть DMF (5 × 5 мл)
- Присоединение следующей аминокислоты (повторить для всей последовательности):
- Растворить Fmoc-aa-OH (3 экв.), HBTU (3 экв.), HOBt (3 экв.) в DMF
- Добавить DIPEA (6 экв.)
- Добавить к смоле, встряхивать 1 час
- Промыть DMF (3 × 5 мл)
- Повторить цикл для следующей аминокислоты
- В позициях i и i+7 вставить Fmoc-Cys(Trt)-OH (тритильная защита тиольной группы)
Пример последовательности: H2N-Ala-Cys-Pro-Gly-Tyr-Arg-Cys-Val-Lys-COOH (Cys в позициях 2 и 7)
Шаг 2: Селективное снятие Trt-защиты с первого Cys
- После сборки полной последовательности (все Fmoc сняты)
- Обработать смолу 1% TFA в DCM (3 × 2 мин):
- Селективно снимает Trt-защиту с Cys, не расщепляя пептид со смолы
- Промыть DCM (5 × 5 мл), затем DMF (3 × 5 мл)
Шаг 3: Алкилирование первого Cys
- Приготовить раствор йодуксусной кислоты (iodoacetic acid):
- 186 мг (1 ммоль) в 5 мл DMF
- Добавить DIPEA (174 мкл, 1 ммоль)
- Добавить к смоле, встряхивать 2 часа в темноте (комнатная температура)
- Промыть DMF (5 × 5 мл)
- Результат: Cys-S-CH2-COOH (карбоксиметилированный цистеин)
Шаг 4: Снятие Trt-защиты со второго Cys
Повторить процедуру из шага 2.
Шаг 5: Циклизация через тиоэфирное сшивание
- Активировать карбоксильную группу первого Cys:
- HBTU (5 экв.), HOBt (5 экв.), DIPEA (10 экв.) в DMF
- Добавить к смоле, встряхивать 4 часа
- Тиольная группа второго Cys атакует активированную карбоксильную группу → образование тиоэфирной связи:
Cys1-S-CH2-COO-activated + HS-Cys2 → Cys1-S-CH2-CO-S-Cys2 + HOBt
- Промыть DMF (5 × 5 мл), DCM (3 × 5 мл)
Шаг 6: Расщепление пептида со смолы
- Приготовить смесь для расщепления (cleavage cocktail):
- TFA : H2O : TIS (triisopropylsilane) = 95 : 2.5 : 2.5
- Обработать смолу 10 мл смеси, встряхивать 2 часа
- Отфильтровать раствор в колбу со 100 мл холодного диэтилового эфира
- Осадок циклического пептида образуется → центрифугировать 10 минут, 4000 об/мин
- Декантировать эфир, промыть осадок эфиром (2×)
- Высушить под вакуумом → неочищенный циклический пептид
4.3. Очистка и характеризация
Очистка методом HPLC:
- Растворить неочищенный пептид в 50% ацетонитрил/вода + 0.1% TFA
- Фильтровать через фильтр 0.22 мкм
- Препаративная HPLC:
- Колонка: C18, 10 мкм, 250 × 20 мм
- Подвижная фаза A: H2O + 0.1% TFA
- Подвижная фаза B: CH3CN + 0.1% TFA
- Градиент: 10-60% B за 30 минут
- Скорость потока: 10 мл/мин
- Детекция: λ = 220 нм
- Собрать фракцию с целевым пептидом
- Лиофилизировать → чистый пептид (белый порошок)
Характеризация:
- ESI-MS (электроспрей масс-спектрометрия):
- Проверить молекулярную массу [M+H]⁺
- Должна соответствовать расчетной для циклического пептида с тиоэфирным мостиком
- LC-MS:
- Чистота >95% (по площади пика при λ = 220 нм)
- NMR (1H, COSY, TOCSY):
- Подтверждение структуры
- Проверка конформации циклического пептида
- Circular Dichroism (CD):
- Определение вторичной структуры (α-helix, β-sheet)
5. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
5.1. Мониторинг синтеза
- Kaiser test (нингидриновый тест): проверка полноты присоединения каждой аминокислоты
- LC-MS анализ после каждого ключевого шага (после алкилирования, после циклизации)
5.2. Проверка стабильности к восстановлению
- Инкубировать пептид с 10 мМ DTT (дитиотреитол) при 37°C, 24 часа
- Анализировать методом LC-MS
- Ожидаемый результат: Тиоэфирная связь не должна расщепляться (пик с исходной молекулярной массой остается)
- Контроль: Дисульфидный аналог полностью восстанавливается до линейного пептида
5.3. Определение периода полураспада в сыворотке
- Инкубировать пептид в человеческой сыворотке при 37°C
- Отбирать аликвоты в точках времени: 0, 1, 2, 4, 8, 24, 48 часов
- Осаждать белки ацетонитрилом, центрифугировать
- Анализировать супернатант методом LC-MS
- Рассчитать t1/2 по уравнению первого порядка:
\[ t_{1/2} = \frac{\ln(2)}{k} \]
где k — константа скорости деградации
Ожидаемый результат: t1/2 = 26-30 часов для тиоэфирного пептида vs 1.4-1.9 минут для дисульфидного
6. ТИПИЧНЫЕ ПРОБЛЕМЫ И РЕШЕНИЯ
| Проблема | Причина | Решение |
|---|---|---|
| Низкий выход циклизации | Неполная активация карбоксильной группы | Увеличить время реакции до 6 часов, использовать 10 экв. HBTU |
| Образование линейного пептида вместо циклического | Расщепление со смолы до циклизации | Проверить, что все защитные группы удалены перед расщеплением |
| Окисление тиольных групп до дисульфида | Контакт с кислородом воздуха | Работать в инертной атмосфере (N2 или Ar), добавить 2% TIS в реакционную смесь |
| Низкая чистота конечного пептида | Побочные продукты от неполной деблокировки | Увеличить время обработки пиперидином до 2 × 20 мин |
7. МОДИФИКАЦИИ МЕТОДА
7.1. Синтез бициклических пептидов
Для пептидов с несколькими Cys (≥4) можно сформировать два тиоэфирных мостика:
Cys1-Cys3: первый тиоэфирный мостик
Cys2-Cys4: второй тиоэфирный мостик
Стратегия:
- Ортогональная защита Cys (Trt и Acm)
- Последовательное снятие защит и циклизация
7.2. Гибридные пептиды (дисульфид + тиоэфир)
Для сложных топологий можно комбинировать:
- Дисульфидный мостик (обратимый) для динамической конформации
- Тиоэфирный мостик (необратимый) для стабилизации ключевых участков
8. БЕЗОПАСНОСТЬ
- TFA: едкий, вызывает ожоги → работать в вытяжном шкафу, защитные очки и перчатки
- Пиперидин: токсичный, резкий запах → вытяжной шкаф
- Йодуксусная кислота: канцероген → избегать контакта с кожей, использовать нитриловые перчатки
- Диэтиловый эфир: легковоспламеняющийся → вдали от открытого пламени
9. ЛИТЕРАТУРА
- Mourtas, S. et al. (2020). Convergent Synthesis of Thioether Containing Peptides. Molecules, 25(1), 204.
- Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides (2018). Nature Protocols, details on thiol-ene chemistry.
- Thioether-Containing Analogues of Comstatin (2011). Journal of Medicinal Chemistry, 52(10), 3039-3045.